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Cellulose DE-52 DEAE 纤维素 DE-52
产品信息:
纤维素DE-52提取法纯化多克隆抗体
该法提取IgG简便,既可小量提取,也可大量制备。
1.批量提取法 称取DEAE-纤维素(DE52)50g,置于1000ml烧杯中,先以蒸馏水漂浮除去细颗粒,再经酸碱处理后,用0.01~0.05mol/L,pH8.0左右的磷酸盐缓冲液(PB)平衡。将水分抽干,或用布氏滤斗(内放两层滤纸)过滤,收集湿纤维素,以降低其离子强度。按1ml血清加湿重5g DE52,经过充分搅拌,置4℃吸附1h。上清液可再如此处理一次,即获得较纯的IgG。该法提取IgG简便,既可小量提取,也可大量制备。
2.Tris-Cl离子交换层析法(Ion-exchange chromatography)
【材料和试剂】
(1)DE52纤维素。
(2)HCl;NaOH;0.01~0.05mol/L,pH8.0 PB;0.01mol/L,pH8.6 Tris-Cl;0.5mol/L NaCl。
(3)待纯化标本:杂交瘤腹水或培养上清,免疫血清或饱和硫酸铵粗提品。
(4)1.5×50cm 层析柱;透析袋;紫外分光光度计及其他透析和层析所需的试剂和器材。
【操作步骤】 Cellulose DE-52 DEAE 纤维素 DE-52
(1)DE52纤维素的处理:DE52经酸、碱处理,0.01mol/L,pH8.6 Tris-Cl平衡。
(2)装柱:将层析柱固定于滴定架上,柱底垫一圆形尼龙纱,出口接一细塑料管并关闭出水。将浸泡于0.01mol/L,pH8.6 Tris-Cl中的DE52沿玻璃棒倒入柱中,待DE52自然沉降3~5cm高时,吸除0.01mol/L,pH8.6 Tris-Cl,或松开出水口螺旋夹,控制流速1~2ml/min,同时连续加入DE52至所需高度。待DE52*沉降后,柱面放一圆形滤纸片。
(3)平衡:松开出水口螺旋夹,以0.01mol/L,pH8.6 Tris-Cl平衡,控制流速为15滴/min,待流出液与洗脱液之pH值达到*时,停止平衡。
(4)待提取样品的准备:将蛋白装入透析袋里,置4℃冰箱,对0.01mol/L pH8.6 Tris-Cl透析。
(5)加样、洗脱与收集:用吸管吸去柱面液体,以毛细吸管沿柱壁加入样品,样品体积相当于柱床体积的1%~2%,蛋白浓度为50~70mg。启开出水口螺旋夹使样品缓慢进入柱床内,并用少量洗脱液清洗柱壁;待液体进入柱床后,以0.01mol/L,pH8.6 Tris-Cl洗脱,控制流速为14~16滴/min。分部收集器收集,紫外监测,或人工收集,以紫外分光光度计分别测定每管280nm OD值,描绘洗脱液峰。
(6)浓缩:将洗脱液的280nm OD上峰段与下峰段各管分别合并,装入透析袋,以PEG浓缩至所需体积。
Tris-PO4离子交换层析法
该法在上述方法的基础上稍加改良,即通过梯度洗脱,可用于血清中IgG和IgM的提取。
【材料和试剂】
(1)DE52纤维素。
(2)待纯化标本:杂交瘤腹水或培养上清,免疫血清或饱和硫酸铵粗提品。
(3)1.5×50cm 层析柱;透析袋及其他透析和层析所需的试剂和器材。
(4)梯度洗脱液包括:0.005 mol/L,pH8.6 Tris-PO4;0.055mol/L,pH6.0 Tris-PO4;.5mol/L,pH5.1 Tris-PO4。
【操作步骤】
(1)蛋白标本对0.005mol/L,pH8.6 Tris-PO4透析。
(2)DE52装柱,并以0.005mol/L,pH8.6 Tris-PO4平衡。
(3)加样,以0.005mol/L,pH8.6 Tris-PO4洗脱,紫外监测直至洗脱液280nm OD回到基线。这一步骤可除去血清中其他蛋白。
(4)以350ml 0.055mol/L,pH6.0 Tris-PO4洗脱,这一步骤可用于纯化血清IgG和IgM。
(5)以125ml 0.055mol/L,pH6.0 Tris-PO4和125ml 0.5mol/L,pH5.1 Tris-PO4梯度洗脱,总量收集250ml;重复步骤(5)。
(6)根据280nm峰值合并蛋白峰,透析浓缩和保存同上。
用过的DE52可用0.01mol/L,pH8.6 Tris-Cl和0.5mol/L NaCl、0.01mol/L,pH8.6 Tris-Cl梯度洗脱回收。再用蒸馏水洗至中性,加入0.02%叠氮钠于4℃保存备用。
性状:干燥细结晶或纤维状
基质 高度交联纤维素
配基 二乙基氨基乙基
配基密度 40μmol /ml
吸附载量 180mg HSA/ml
填料的颗粒大小 50μm
zui大流速 300cm/h
pH范围 3-10,在位清洗时pH范围可到2-11
化学稳定性 各种缓冲液及盐,0.5M NaOH及醋酸,8M脲,6M盐酸胍,乙醇,异丙醇等
物理稳定性 0.1M中性缓冲液中,120℃30min
层析柱装填
1)组装柱(如有需要连接装柱器)。
2)取下下柱头用装柱缓冲液冲洗柱底适配器,排除筛网下面的气泡,将下柱头安装
在层析柱底部,旋紧调整旋钮,并在层析柱底部保留 1cm 左右高度的液体。
3)用装柱缓冲液重悬介质,制成 50%~75%左右的介质悬浮液。
4)一次性将介质倒入柱管中,避免产生气泡。
5)如连接有装柱器,立即往装柱器中缓慢加入装柱缓冲液。将适配器或装柱器上盖
与层析系统相连接。
6)设定所需流速+,打开柱下端,启动泵,进行压柱。
7)柱床稳定后保持 30min 以上,关闭泵和底阀
8)如连接有装柱器,移除装柱器后连接适配器。
9)调节适配器,使其固定在胶面上 0.5~1cm 处,并保证适配器入口充满液体。
10)打开底阀,连接泵,继续用设定的流速(注意压力不要超过 0.3Mpa)继续压柱
待胶面高度保持不变,标记此时胶面高度
11)暂停机器,关闭底阀,断开柱头入口,调低适配器至胶面下 3~5mm 处。封闭
上柱口,装柱完成。
蛋白层析柱/蛋白纯化柱(一端柱床可调,螺纹型) | |||||
内径(mm) | 耐压(bar) | 床层高度(mm) | 床层体积(mL) | 床层高度(mm) | 货号(玻璃) |
10 | 5 | 100 | 0-7 | 0-100 | LK10100 |
10 | 200 | 4月15日 | 55-200 | LK10200 | |
10 | 400 | 20-31 | 255-400 | LK10400 | |
10 | 600 | 35-47 | 455-600 | LK10600 | |
10 | 800 | 51-62 | 655-800 | LK10800 | |
10 | 1000 | 67-78 | 855-1000 | LK101000 | |
15 | 5 | 100 | 0-17 | 0-100 | LK15100 |
15 | 200 | 9.7-35.3 | 55-200 | LK15200 | |
15 | 400 | 45-70 | 255-400 | LK15400 | |
15 | 600 | 80-106 | 455-600 | LK15600 | |
15 | 800 | 116-141 | 655-800 | LK15800 | |
15 | 1000 | 151-176 | 855-1000 | LK151000 | |
20 | 5 | 100 | 0-31 | 0-100 | LK20100 |
20 | 200 | 17-63 | 55-200 | LK20200 | |
20 | 400 | 80-126 | 255-400 | LK20400 | |
20 | 600 | 143-188 | 455-600 | LK20600 | |
20 | 800 | 205-251 | 655-800 | LK20800 | |
20 | 1000 | 268-314 | 855-1000 | LK201000 | |
25 | 5 | 100 | 0-49 | 0-100 | LK25100 |
25 | 200 | 27-98 | 55-200 | LK25200 | |
25 | 400 | 125-196 | 255-400 | LK25400 | |
25 | 600 | 223-294 | 455-600 | LK25600 | |
25 | 800 | 321-392 | 655-800 | LK25800 | |
25 | 1000 | 419-490 | 855-1000 | LK251000 | |
37 | 5 | 100 | 0-107 | 0-100 | LK37100 |
37 | 200 | 59-214 | 55-200 | LK37200 | |
37 | 400 | 274-430 | 255-400 | LK37400 | |
37 | 600 | 488-644 | 455-600 | LK37600 | |
37 | 800 | 703-859 | 655-800 | LK37800 | |
37 | 1000 | 918-1074 | 855-1000 | LK371000 | |
50 | 5 | 100 | 0-196 | 0-100 | LK50100 |
50 | 200 | 108-392 | 55-200 | LK50200 | |
50 | 400 | 500-785 | 255-400 | LK50400 | |
50 | 600 | 893-1177 | 455-600 | LK50600 | |
50 | 800 | 1285-1570 | 655-800 | LK50800 | |
50 | 1000 | 1678-1962 | 855-1000 | LK501000 |
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