层析柱的装填好坏直接影响其分配效果

　　在蛋白质的分离纯化过程中，离不开层析柱的使用，但层析柱的装填好坏，直接影响其分配效果，进而影响产品的回收率及纯度。
 

　　目前，国内外工业级层析柱的装填方法主要为吸入式和置换式两种。置换式在装填小直径层析柱时效果很好，但在层析柱直径较大时(通常直径在800mm以上)分配效果较差。因此广泛采用的装填方法为吸入式，即通过层析柱柱头下压至层析柱底部，将预先混匀的匀浆液通过活塞的方式吸入层析柱内。
 

　　层析柱是凝胶层析技术中的主体，一般用玻璃管或有机玻璃管。根据样品混合物中各组分在固定相和流动相中分配系数不同，从而分离的一种层析法。柱层析技术又称柱色谱技术，主要原理是根据样品混合物中各组分在固定相和流动相中分配系数不同，经多次反复分配将组分分离开来。

 

　　柱层析操作时，先在圆柱管中先填充不溶性基质，形成一个固定相。将样品加到柱子上，用特殊溶剂洗脱，溶剂组成流动相。在样品从柱子上洗脱下来的过程中，根据样品混合物中各组分在固定相和流动相中分配系数不同，经多次反复分配将组分分离。层析柱的直径大小不影响分离度，样品用量大，可加大柱的直径，一般制备用凝胶柱，直径大于2厘米，但在加样时应将样品均匀分布于凝胶柱床面上。
 

　　柱层析的上样也有干法和湿法之分：干法就是把待分离的样品用少量溶剂溶解后，在加入少量硅胶，拌匀后再旋去溶剂。如此得到的粉末再小心加到柱子的顶层。
 

　　干法上样较麻烦，但可以保证样品层很平整。湿法上样就是用少量溶剂(最好就是展开剂，如果展开剂的溶解度不好，则可以用一极性较大的溶剂，但必须少量)将样品溶解后，再用胶头滴管转移得到的溶液，沿着层析柱内壁均匀加入。然后用少量溶剂洗涤后，再加入。