亲和层析空柱是生物大分子(如重组蛋白、抗体)纯化中的核心工具，尤其适用于His-tag、GST或Protein A/G等特异性结合体系。与预装柱相比，空柱具有成本低、灵活性高、可定制填料等优势，但其性能高度依赖规范的操作流程。以下是标准化使用全流程详解。
一、亲和层析空柱准备与检查
使用前需确认空柱无裂纹、接口密封良好，内壁光滑无残留。用去离子水或20%乙醇冲洗柱体，排除颗粒杂质，并确保筛板孔径(通常为20–50μm)与所选填料匹配，防止填料泄漏。
二、填料装填(关键步骤)
浆料制备：将亲和填料(如Ni-NTA琼脂糖)充分混匀成均匀浆液，避免气泡。
匀速装柱：采用恒流泵或重力法将浆料一次性倒入空柱，保持连续流动，防止分层。推荐流速为100–300 cm/h(依填料说明书)。
沉降与平衡：让填料自然沉降至所需床高，连接系统后以5–10倍柱体积(CV)的平衡缓冲液(如PBS或Tris-HCl)冲洗，直至pH和电导稳定。
三、上样与洗脱
样品需澄清无颗粒，避免堵塞。上样流速宜慢(50–150 cm/h)，确保目标蛋白充分结合。随后用洗涤缓冲液去除非特异性吸附杂质，最后用洗脱缓冲液(如含咪唑或低pH溶液)收集目标蛋白。
四、清洗与再生
每次运行后，依次用以下溶液处理：
1–2 CV 0.5 M NaOH(去除内毒素与强吸附杂质)；
1–2 CV平衡缓冲液再生结合位点；
20%乙醇保存(4℃避光)，防止微生物滋生。
五、亲和层析空柱柱效验证
定期通过丙酮或蓝色葡聚糖测定柱效(理论塔板数)和对称因子，若出现峰拖尾或压力升高，提示需重新装柱或更换筛板。
规范操作不仅能提升回收率与纯度，还可延长空柱使用寿命达数十次以上。建议建立标准操作规程(SOP)并记录每批次参数，确保实验可重复性与工艺稳健性。
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